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Western blot,內(nèi)參蛋白選用技巧!

更新時(shí)間:2017-09-12點(diǎn)擊次數(shù):4700

一、Western Blot實(shí)驗(yàn)為什么要用內(nèi)參?

Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行內(nèi)參校正已成為一種慣例。目的蛋白表達(dá)量的相對(duì)多少,前提條件是等量的組織細(xì)胞蛋白上樣,才有比較的基礎(chǔ),特別是表達(dá)量不高時(shí),上樣量的的差別就很有可能影響結(jié)果的分析。因此,在Western Blot試驗(yàn)中,進(jìn)行內(nèi)參的檢測,有以下兩點(diǎn)作用:

 

1、校正蛋白質(zhì)定量、上樣過程中存在的誤差,實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性;

2、使用內(nèi)參可以作為空白對(duì)照,檢測蛋白轉(zhuǎn)膜情況是否、整個(gè)Western Blot顯色發(fā)光體系是否正常。

 

二、你的內(nèi)參選對(duì)了嗎?

作為內(nèi)參的蛋白要符合的標(biāo)準(zhǔn),可從以下幾方面入手:

1、先要考慮的就是實(shí)驗(yàn)樣本來源于什么物種。

樣本來源

選擇內(nèi)參

哺乳動(dòng)物組織或細(xì)胞

β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B、Histone H3、Na,K atpase等

植物來源

plant actin、Rubisco

其他來源樣本研究較少

應(yīng)參照文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo),選擇合適的蛋白作為內(nèi)參。

 

2、內(nèi)參的檢測帶與那些目標(biāo)蛋白的檢測帶在分子量上有所不同;

選擇內(nèi)參抗體時(shí),應(yīng)該考慮目的蛋白分子量的大小。通常應(yīng)該目的蛋白與內(nèi)參蛋白分子量相差5KD以上。比如目的蛋白分子量為45KD,此時(shí)不適宜選擇β-actin作為內(nèi)參,可以考慮選擇GAPDH或者β-tubulin作為內(nèi)參。

 

針對(duì)不同樣品制備常用的內(nèi)參以及它們的分子量

3、要考慮目的蛋白表達(dá)部位

就一般的蛋白檢測來說,β-actin、β-Tubulin抗體等就可以了,而針對(duì)于核蛋白的定量,特別是樣本蛋白就是核蛋白時(shí),選擇恰當(dāng)?shù)暮说鞍變?nèi)參則更能體現(xiàn)內(nèi)部參照的價(jià)值。常用的核內(nèi)參抗體有Lamin A、Lamin B、Histone H3,除此之外,其它常見的核蛋白內(nèi)參還有PCNA、K70、K80等,在一些文獻(xiàn)報(bào)道中,Erk2、TATA binding protein(TBP)以及c-Jun、c-Fos等都有使用。而對(duì)于膜蛋白檢測,常用的內(nèi)參抗體為Na,K ATPase。對(duì)于線粒體蛋白的檢測,常用VDAC1和COX IV作為內(nèi)參抗體。

 

4、實(shí)際的實(shí)驗(yàn)環(huán)境

有些細(xì)胞在某些條件下內(nèi)參表達(dá)會(huì)出現(xiàn)異常,使其不適合做內(nèi)參。

①某些細(xì)胞中,由于組織缺氧、糖尿病等因素會(huì)導(dǎo)致GAPDH的表達(dá)增高,不適合做內(nèi)參。

②在凋亡實(shí)驗(yàn)時(shí),Lamin等也不適合作為內(nèi)參。

③在加入抗癌和抗真菌藥物時(shí),Tubulin的表達(dá)易受影響,不適合作為內(nèi)參。

④Lamin B不適合作為胚胎干細(xì)胞的內(nèi)參,而PCNA不適合作為非增殖細(xì)胞的內(nèi)參等。其他具體可查詢相應(yīng)文獻(xiàn)。

 

5、不同的組織特異性

actin 即肌動(dòng)蛋白,是細(xì)胞的一種重要骨架蛋白。actin 大致可分為六種,其中四種是不同肌肉組織特異性的,包括alpha-skeletal muscle actin、alpha-cardiac muscle actin、alpha-smooth muscle actin和gamma-smooth muscle actin。這些不同的亞型組織分布是不一樣的,在肌肉組織中beta-actin分布就很少,心肌主要是alpha-cardiac muscle actin。因此不同的組織本來就應(yīng)該選擇不同的內(nèi)參。

 

三、實(shí)驗(yàn)中使用內(nèi)參的方法你知多少?

在Western Blotting實(shí)驗(yàn)過程中使用內(nèi)參的方法通常有以下三種。

1、超級(jí)簡便的標(biāo)記內(nèi)參使用法,只要在二抗孵育時(shí)加入HRP標(biāo)記內(nèi)參抗體,按照正常操作即可;

 

2、普通內(nèi)參,當(dāng)目的蛋白的分子量大小與選用的內(nèi)參蛋白分子量相差不大時(shí),可以先進(jìn)行目的蛋白的抗體溫育顯色和檢測,然后使用Strip緩沖液洗掉膜上的抗體,重新進(jìn)行內(nèi)參蛋白的抗體溫育、顯色檢測。

 

3、當(dāng)目的蛋白的分子量大小與選用的內(nèi)參蛋白分子量大小相差比較明顯情況下,可以在轉(zhuǎn)膜后預(yù)染,根據(jù)蛋白質(zhì)Marker的大小將膜剪為大分子量和小分子量兩部分,使內(nèi)參蛋白與目的蛋白分開,然后兩塊膜分別與內(nèi)參蛋白抗體以及目的蛋白抗體進(jìn)行溫育,二抗溫育以及顯色。

 

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