国产精品视频一区,天堂AV无码大芭蕉伊人AV,欧美交A欧美精品喷水,中文无码一区二区三区在线观看

技術(shù)文章

Technical articles

當(dāng)前位置:首頁技術(shù)文章Western blot,內(nèi)參蛋白選用技巧!

Western blot,內(nèi)參蛋白選用技巧!

更新時(shí)間:2017-09-12點(diǎn)擊次數(shù):4700

一、Western Blot實(shí)驗(yàn)為什么要用內(nèi)參?

Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行內(nèi)參校正已成為一種慣例。目的蛋白表達(dá)量的相對(duì)多少,前提條件是等量的組織細(xì)胞蛋白上樣,才有比較的基礎(chǔ),特別是表達(dá)量不高時(shí),上樣量的的差別就很有可能影響結(jié)果的分析。因此,在Western Blot試驗(yàn)中,進(jìn)行內(nèi)參的檢測,有以下兩點(diǎn)作用:

 

1、校正蛋白質(zhì)定量、上樣過程中存在的誤差,實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性;

2、使用內(nèi)參可以作為空白對(duì)照,檢測蛋白轉(zhuǎn)膜情況是否、整個(gè)Western Blot顯色發(fā)光體系是否正常。

 

二、你的內(nèi)參選對(duì)了嗎?

作為內(nèi)參的蛋白要符合的標(biāo)準(zhǔn),可從以下幾方面入手:

1、先要考慮的就是實(shí)驗(yàn)樣本來源于什么物種。

樣本來源

選擇內(nèi)參

哺乳動(dòng)物組織或細(xì)胞

β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B、Histone H3、Na,K atpase等

植物來源

plant actin、Rubisco

其他來源樣本研究較少

應(yīng)參照文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo),選擇合適的蛋白作為內(nèi)參。

 

2、內(nèi)參的檢測帶與那些目標(biāo)蛋白的檢測帶在分子量上有所不同;

選擇內(nèi)參抗體時(shí),應(yīng)該考慮目的蛋白分子量的大小。通常應(yīng)該目的蛋白與內(nèi)參蛋白分子量相差5KD以上。比如目的蛋白分子量為45KD,此時(shí)不適宜選擇β-actin作為內(nèi)參,可以考慮選擇GAPDH或者β-tubulin作為內(nèi)參。

 

針對(duì)不同樣品制備常用的內(nèi)參以及它們的分子量

3、要考慮目的蛋白表達(dá)部位

就一般的蛋白檢測來說,β-actin、β-Tubulin抗體等就可以了,而針對(duì)于核蛋白的定量,特別是樣本蛋白就是核蛋白時(shí),選擇恰當(dāng)?shù)暮说鞍變?nèi)參則更能體現(xiàn)內(nèi)部參照的價(jià)值。常用的核內(nèi)參抗體有Lamin A、Lamin B、Histone H3,除此之外,其它常見的核蛋白內(nèi)參還有PCNA、K70、K80等,在一些文獻(xiàn)報(bào)道中,Erk2、TATA binding protein(TBP)以及c-Jun、c-Fos等都有使用。而對(duì)于膜蛋白檢測,常用的內(nèi)參抗體為Na,K ATPase。對(duì)于線粒體蛋白的檢測,常用VDAC1和COX IV作為內(nèi)參抗體。

 

4、實(shí)際的實(shí)驗(yàn)環(huán)境

有些細(xì)胞在某些條件下內(nèi)參表達(dá)會(huì)出現(xiàn)異常,使其不適合做內(nèi)參。

①某些細(xì)胞中,由于組織缺氧、糖尿病等因素會(huì)導(dǎo)致GAPDH的表達(dá)增高,不適合做內(nèi)參。

②在凋亡實(shí)驗(yàn)時(shí),Lamin等也不適合作為內(nèi)參。

③在加入抗癌和抗真菌藥物時(shí),Tubulin的表達(dá)易受影響,不適合作為內(nèi)參。

④Lamin B不適合作為胚胎干細(xì)胞的內(nèi)參,而PCNA不適合作為非增殖細(xì)胞的內(nèi)參等。其他具體可查詢相應(yīng)文獻(xiàn)。

 

5、不同的組織特異性

actin 即肌動(dòng)蛋白,是細(xì)胞的一種重要骨架蛋白。actin 大致可分為六種,其中四種是不同肌肉組織特異性的,包括alpha-skeletal muscle actin、alpha-cardiac muscle actin、alpha-smooth muscle actin和gamma-smooth muscle actin。這些不同的亞型組織分布是不一樣的,在肌肉組織中beta-actin分布就很少,心肌主要是alpha-cardiac muscle actin。因此不同的組織本來就應(yīng)該選擇不同的內(nèi)參。

 

三、實(shí)驗(yàn)中使用內(nèi)參的方法你知多少?

在Western Blotting實(shí)驗(yàn)過程中使用內(nèi)參的方法通常有以下三種。

1、超級(jí)簡便的標(biāo)記內(nèi)參使用法,只要在二抗孵育時(shí)加入HRP標(biāo)記內(nèi)參抗體,按照正常操作即可;

 

2、普通內(nèi)參,當(dāng)目的蛋白的分子量大小與選用的內(nèi)參蛋白分子量相差不大時(shí),可以先進(jìn)行目的蛋白的抗體溫育顯色和檢測,然后使用Strip緩沖液洗掉膜上的抗體,重新進(jìn)行內(nèi)參蛋白的抗體溫育、顯色檢測。

 

3、當(dāng)目的蛋白的分子量大小與選用的內(nèi)參蛋白分子量大小相差比較明顯情況下,可以在轉(zhuǎn)膜后預(yù)染,根據(jù)蛋白質(zhì)Marker的大小將膜剪為大分子量和小分子量兩部分,使內(nèi)參蛋白與目的蛋白分開,然后兩塊膜分別與內(nèi)參蛋白抗體以及目的蛋白抗體進(jìn)行溫育,二抗溫育以及顯色。

 

亚洲AV永久无码精品天堂动漫 | 男与女 电影| 无码人妻少妇色欲AV一区二区| 日韩精品无码中文字幕一区二区| 扒开她粉嫩的小缝尿进去h漫画| JZZIJZZIJ亚洲乱熟无码| 亚洲人成色777777精品| 按摩硬进去做着做着软了| 被猛男cao烂的小男生gv| 国产乱人伦真实精品视频| 最近中文字幕完整在线看一 | 国产精品人妻一区夜夜爱| 伸进内衣揉捏她的乳尖| 久久午夜夜伦鲁鲁片无码免费| 国产精品VA在线观看无码| 亲子乱av视频一区二区| 真人高清实拍女处被破的视频| 搡老熟女国产| 丰满双乳秘书被老板狂揉捏| 爱唯侦察| 扒开腿狂躁女人视频免费| 久久久久人妻一区精品色| 久久亚洲精品AB无码播放| 奇米777 米奇影视狠狠| 黑人巨大跨种族video| 97人人爽人人爽人人人片av| 99久久人妻精品免费二区| 亚洲AV日韩AV高潮潮喷无码 | 精品人妻人人做人人爽夜夜爽| 亚洲AV无码国产精品色软件| 亚洲国产成人精品无码区花野真一 | 精产国品一二三产区区别| 妓院里的中国姑娘| 亚洲欧美日本| 高潮VPSWINDOWS国产乱| 无码视频一区二区三区| 护士人妻HD中文字幕| 中文字幕AV一区二区三区| 人妻无码久久久久久久久久久| 极品少妇被啪到呻吟喷水| 四虎成人精品无码永久在线|